Basaal wetenschappelijk onderzoek

 
Molecular Nerve Repair
Het programma "Molecular Nerve Repair” kent twee onderzoekslijnen.
 
  1. Neuromics - biologie van het neuroom
  2. Gentherapie – stimuleren van perifere zenuwregeneratie door middel van virale vector gemedieerde gentransfer.
Neuromics - biologie van het neuroom
Plexus brachialis letsel leidt zelden tot een volledige afscheuring van de zenuwenbanen. In plaats daarvan raken de axonen (de uitlopers van de zenuwcellen) binnen in de zenuw en de isolatiemantel beschadigd (figuur 1). Onder ideale omstandigheden kunnen beschadigde axonen opnieuw uitgroeien vanaf het letsel terug naar de doelorganen zoals bijvoorbeeld de spieren in de arm en hand. Soms ontstaat er op de plaats van het letsel een littekenachtig weefsel in de beschadigde zenuw, een zogenaamd neuroma-in-continuďteit (NIC) (figuur 1). Een NIC blijkt ondanks de ogenschijnlijke continuďteit van de zenuw een grote barričre te zijn voor regenerende axonen. De groeiende axon-uitlopers zijn veelal niet instaat door het NIC terug naar hun doelorganen te groeien, dit heeft als gevolg dat de spieren niet kunnen worden aangestuurd en daardoor permanent verlamd zijn.
 
 
Figuur 1. Schematisch overzicht van een perifeer zenuwletsel dat leidt tot de vorming van een neuroma-in-continuďteit. Gedeeltelijke beschadiging van de isolatiemantel en het axon kunnen leiden tot de vorming van een litteken-achtig weefsel op de plaats van de schade. Axonen voor het beschadigde gebied zijn nog keurig georganiseerd en kunnen opnieuw uitgroeien tot in het beschadigde gebied. Echter in het beschadige gebied raken de axonen "de weg kwijt” en onstaat er een chaotisch uitgroei patroon. In de meeste gevallen zullen de axonen niet meer in staat zijn door het neuroom heen te groeien en hun doelorganen (bijv. spieren) te bereiken. Het gevolg hiervan in dat de spieren niet kunnen worden aangestuurd.
 
Daar tot op heden niet duidelijk is waarom het NIC een barričre vormt voor regenerende axonen zijn wij een onderzoek gestart naar de cellulaire en moleculaire eigenschappen van het NIC. In eerste instantie is het doel van dit onderzoek inzicht te krijgen in welke celtypen het NIC vormen en hoe dit anders is dan de opbouw van een normale gezonde zenuw. Daarnaast willen we weten welke moleculen door deze cellen worden gemaakt en hoe deze de (andere) cellen en de axonen in het NIC beďnvloeden. Uiteindelijk hopen we deze kennis te toe te passen bij de ontwikkeling van neuroom modellen die kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek naar de therapeutische mogelijkheden om de vorming van een NIC te beperken of voorkomen. Voor ons wetenschappelijk-onderzoek maken wij gebruik van patienten materiaal (na informed consent) uit de kliniek dat overblijft na reconstructie-chirugie van Plexus brachialis lestels.
 
Cellulaire karakterisering van het NIC
Een eerste vinding uit ons onderzoek is dat NIC weefsel heel veel delende cellen bevat. Dit betekent dat het neuroom, 5 maanden na het ontstaan van de initiële schade waarschijnlijk nog steeds aan het groeien is. Ten tweede hebben we ontdekt dat twee celtypen veel meer in neuroom weefsel voorkomen dan in normaal zenuwweefsel. Dit zijn cellen die normaal betrokken zijn bij wondheling en litteken vorming (pericyten/myofibroblasten), en cellen die nieuwe bloedvaten (endotheel cellen) vormen (figuur 2). Verder onderzoek zal moeten uitwijzen of deze twee celtypen over-actief zijn in het NIC waardoor er teveel litteken-achtig weefsel wordt gevormd dat vervolgens de uitgroei van zenuwuitlopers terug naar de spieren zou kunnen verstoren.
 
 
Figuur 2. Immunohistochemie op vries-coupes van proximale (normaal) zenuw en neuroma-in-continuďteit laat zien dat er in het neuroom weefsel meer delende cellen (phospho-Histone H3 positief, groen) aanwezig zijn in vergelijking tot in normaal zenuwweefsel. Het aantal cellen (DAPI, blauw) is vrijwel onveranderd. Een kleuring voor "smooth muscle actin” laat grote aantallen pericyten/myofibroblasten (SMA positief, rood) zien in neuroma weefsel. In de proximale zenuw zijn deze cellen alleen te vinden langs de bloedvaten.
 
Moleculaire karakterisering van het NIC
Het onderzoek naar het moleculaire profiel (met behulp van microarray) van het NIC geeft niet alleen inzicht in de processen die betrokken zijn bij de vorming van het NIC zelf maar geeft ook inzicht in hoe het NIC de teruggroei van nieuwe axonen naar de doelorganen mogelijk verhinderd. We vinden dat er ten opzichte van normaal zenuwweefsel in het NIC veel processen actief zijn die resulteren in de aanmaak van bindweefsel. Overtollige produktie van bindweefsel zou de struktuur van de zenuw op de plaats van het letsel kunnen verstoren waardoor uitgroeiende axonen de weg naar hun doelgebied niet meer kunnen vinden. Daarnaast blijken er in het NIC weefsel veel factoren aanwezig te zijn die tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel werken als remmers van axongroei, zogenaamde chemo-repulsieve factoren. Dit zou kunnen betekenen dat de nieuwe axonen mogelijk actief geremd worden in hun groei door de aanwezigheid van deze chemo-repulsieve factoren in het NIC (figuur 3).
 
 
Figuur 3. Produktie van axon groei remmende factoren door cellen in het neuroom zou medeverantwoordelijk kunnen zijn voor regeneratie problemen na perifere zenuwschade.
 
Chemo-repulsieve factor Wnt5a
Eén van de groei-remmmende factoren die sterk aanwezig is in het NIC is het eiwit Wnt5a. Wnt5a is een axongroei remmend eiwit dat normaal niet alleen een belangrijke rol speelt bij het aanleggen van het zenuwstelsel maar waarvan ook is aangetoond dat het een remmer is van regeneratie in het beschadigde centrale zenuwstelsel (ruggenmerg). Momenteel proberen we in samenwerking met Prof. Dr. J. Noordermeer (Moleculaire Celbiologie, LUMC) te bepalen wat de rol van Wnt5a in het NIC is en of Wnt5a ook in het beschadige perifere zenuwstelsel een axongroei remmende werking heeft.
 
Gentherapie – stimuleren van perifere zenuwregeneratie door middel van virale vector gemedieerde gentransfer
Het resultaat van een chirurgische ingreep na ernstig traumatisch letsel van het perifere zenuwstelsel is vaak beperkt. Hoewel het resultaat van een chirurgische ingreep over het algemeen gunstig is; hebben patiënten vaak toch nog last van verminderde sensorische functie, spierkracht en neuropathische pijn. De huidige chirurgische ingrepen bestaan ​​voornamelijk uit reconstructieve technieken met of zonder het gebruik van een zenuw-transplantaat. Momenteel hebben deze technieken bijna een perfecte verfijning bereikt en zijn er nieuwe aanvullende therapeutische strategieën nodig om regeneratie nog verder te verbeteren. Eén van deze veelbelovende strategieën is gen-therapie (figuur 4). Het afgelopen decennium zijn Adeno-associated virale en Lentivirale vectoren ontwikkeld ​​als een krachtige methode om therapeutische genen tot expressie te brengen in diverse weefsel typen. Wij onderzoeken momenteel of deze virale vectoren ook kunnen worden gebruikt om in de toekomst perifere zenuwregeneratie in patienten te verbeteren.
 
 
 
Figuur 4. Schematisch overzicht van het principe gentherapie. DNA dat codeert voor een therapeutisch gen (1) wordt in een transfervector gezet (2). Deze vector wordt gebruikt om virale vector deeltjes (3) te maken. Deze vectordeeltjes kunnen worden geďnjecteerd in de zenuw, in dit geval de ellepijpzenuw (4). De virale vector deeltjes gaan de Schwann cellen binnen en leveren hun genetisch materiaal, waaronder het therapeutische gen (5) af aan de kern van de Schwann cellen die vervolgens beginnen met de produktie van het gewenste therapeutische eiwit (groene stippen).
 
Eén van de mogelijke toepassingen van virale vector gemedieerde gen-therapie zou het verbeteren van perifere zenuwtransplantaten kunnen zijn. Wij hebben aangetoond dat deze virale vectoren effectieve langdurige expressie van therapeutische genen in de beschadigde zenuwen en in zenuwtransplantaten (zoals bijv. de humane Nervus suralis, figuur 5) kunnen bewerkstelligen. Virale vector gemedieerde expressie van bepaalde therapeutische genen (bijv. sommige neurotrofe factoren) heeft een positief effect op het aantal zenuwvezels dat het zenuw-transplantaat in groeit in ratten. Echter is ook gebleken dat continue hoge lokale aanwezigheid van sommige neurotrofe factoren succesvolle regeneratie beperkt (figuur 6). Groeiende zenuwvezels blijven ‘hangen’ in het gebied met hoge concentraties neurotrofe factor en groeien niet verder naar hun doelorganen. Een mogelijke oplossing voor dit probleem is het ontwikkelen van een reguleerbaar viraal vector systeem waarbij de expressie van de neurotrofe factor tijdelijk aanstaat en weer kan worden uitgezet als het z’n werk gedaan heeft.
 
 
Figuur 5. Virale vector gemedieerde transgen-expressie (groen) in een humane zenuw (nervus suralis) die veel gebruikt wordt als zenuwtransplantaat.
 
 
Figuur 6. Virale vector gemedieerde expressie van het therapeutische-gen GDNF in een beschadigde zenuw van een rat resulteerd in de uitgroei van veel axonen (zwart) in de zenuw. Helaas groeien de nieuwe axonen niet door naar hun verder gelegen doelorganen maar blijven ze in het gebied met de hoogste GDNF concentratie hangen en vormen zogenoemde axon coils.
 
Een reguleerbaar systeem dat bewezen heeft werkzaam te zijn is het tetracycline-afhankelijke genregulatie systeem waarbij een transgen (bijv. een neurotrofe factor) onder controle staat van een induceerbare promotor. In samenwerking met Prof. Dr. R. C. Hoeben (Moleculaire Celbiologie, LUMC) werken we aan een verbeterd tetracycline gereguleerd viraal expressie systeem dat ‘onzichtbaar’ gemaakt is voor het immuunsysteem. Momenteel testen we zowel de reguleerbaarheid en de immunogeniciteit van dit nieuwe system in-vitro en in-vivo.
 
Samenwerking
Het onderzoek wordt verricht in het Nederlands Herseninstituut in het Laboratorium voor Neuroregeneratie onder leiding van Prof. Dr. J. Verhaagen en Prof. Dr. M.J.A. Malessy, Neurochirurg, LUMC.
 
Er wordt samengewerkt met de sectie "Virus en stamcel biologie” van Prof. Dr. R. Hoeben, onderdeel van de afdeling Moleculaire Celbiologie (MCB), LUMC. Dit werk richt zich op het toepassen van de "stealth”-technologie met het doel immuun-neutrale virale vectoren met reguleerbare therapeutische transgen expressie te genereren. Deze vectoren zullen worden toegepast in het bovengenoemde onderzoeksprogramma.
 
Tevens wordt er samengewerkt met Prof. Dr. J. Noordermeer, MCB, LUMC. Dit onderzoek richt zich op het gebied van axon guidance moleculen en wordt uitgevoerd in de Drosophila. Recent zijn samenwerkingsverbanden gestart met Prof. Dr. A. Dahan, afdeling anesthesiologie op het gebied van neuropathische pijn en met Dr. F. van Leeuwen op het gebied van de ontwikkeling van peroperatieve visualisatie van zenuwen met behulp van imaging agents.
 
Internationale samenwerking
Internationale samenwerkingsverbanden bestaan met Prof. Dr. R. Spinner, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota (Artificial nerve) en Prof. Dr. T. Gordon, University of Alberta, Canada (Electrical stimulation).